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RNA結(jié)合蛋白（RBP）與其RNA靶點動態(tài)相互作用，在轉(zhuǎn)錄斜棚、剪接笼糙、修飾斧吐、定位匈歼、翻譯和降解等各個方面調(diào)節(jié)RNA的命運粥谬。RBP本身或其與RNA的結(jié)合出現(xiàn)功能障礙锄垛，可能導致各種缺陷甚至疾病哺里。有效捕捉RBP-RNA相互作用勘职，特別是動態(tài)甚至瞬時相互作用的方法恋得，對于更好地理解RBP及其對RNA靶點的功能作用至關(guān)重要。

但目前仍缺乏有效方法來捕獲RBP與其RNA靶點之間的穩(wěn)定和瞬時相互作用，特別是當相互作用是動態(tài)的此妙，或是樣本量有限時侵宝。

2024年1月10日，芝加哥大學何川教授團隊在 Nature Methods 期刊發(fā)表了題為：Profiling of RNA-binding protein binding sites by in situ reverse transcription-based sequencing 的研究論文殃通。

該研究開發(fā)了一種基于逆轉(zhuǎn)錄酶的RBP結(jié)合位點測序方法——ARTR-seq攘默，該方法依賴于抗體引導下的RBP結(jié)合RNA的原位逆轉(zhuǎn)錄來識別RBP結(jié)合位點。ARTR-seq避免了紫外交聯(lián)和免疫沉淀昔搂，從而能夠從20個細胞或一個組織切片中高效和特異地識別RBP結(jié)合位點玲销。利用快速甲醛固定，ARTR-seq可以在短時間內(nèi)（10分鐘）捕獲RBP的動態(tài)RNA結(jié)合摘符。

廣泛使用的識別RBP的靶點的方法是基于特定RBP及其結(jié)合RNA的免疫沉淀（IP）贤斜，通過直接RNA免疫沉淀（RIP）或共價捕獲輔助的交聯(lián)沉淀（CLIP），通過RIP或CLIP使用靶向RBP的抗體來富集與特定RBP結(jié)合的底物RNA逛裤，然后進行高通量測序來描繪整個轉(zhuǎn)錄組中的RBP靶點瘩绒。CLIP-seq通過共價交聯(lián)捕獲底物RNA上的RBP結(jié)合位點。RNase處理消化RNA的無RBP區(qū)域带族，提高了結(jié)合位點檢測的分辨率锁荔。CLIP-seq變體如PAR-CLIP或eCLIP提高了交聯(lián)效率、特異性或結(jié)合位點分辨率蝙砌。

雖然這些方法有效且廣泛使用阳堕，但也有局限性。由于免疫沉淀效率低择克，它們通常需要大量的起始材料恬总，基于CLIP的方法中的紫外線交聯(lián)是一種低效率的化學反應。最近報道的tRIP-seq和LACE-seq可以應用于低輸入樣本肚邢，但以降低文庫復雜度為代價辱雅。

TRIBE和STAMP方法將RBP與RNA堿基編輯器融合，在RBP結(jié)合位點附近引入突變苛每，繞過免疫沉淀來識別RBP結(jié)合位點怨颜。這些方法可以輕松應用于活細胞中研究RBP結(jié)合，并以有限的材料達到單細胞水平蒋巡，然而凫荡，這些基于堿基編輯的方法仍然存在局限性。它們需要在生殖細胞系或細胞系中插入堿基編輯蛋白肚苇，從而進行基因組操作功抠，阻礙了它們在原代細胞和組織中的應用。誘導編輯蛋白的表達通常需要大約24小時或更長時間蚣锌，無法用于監(jiān)測RBP與RNA的動態(tài)結(jié)合耘昙。此外沈路，這些堿基編輯器有自己的序列偏好，可能會改變目標RBP的天然結(jié)合譜谓墨。

近期還有研究團隊開發(fā)了基于CUT&Tag策略的新方法——RT&Tag加六，這種方法可以識別聚腺苷酸RNA中的RBP結(jié)合，但對非聚腺苷酸RNA和胞質(zhì)RBP結(jié)合無效怒见。而且由于其使用的Tn5酶在異源雙鏈上的效率較低俗慈，需要25000-100000個細胞核才能獲得足夠的轉(zhuǎn)錄組范圍的結(jié)合信號。

在這項研究中遣耍，何川團隊為了克服現(xiàn)有方法的局限性闺阱，提出了一種基于逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）的RBP結(jié)合位點測序方法——ARTR-seq，通過原位逆轉(zhuǎn)錄酶捕獲RBP-RNA相互作用舵变。

實驗結(jié)果顯示酣溃，ARTR-seq可以靈敏描繪RBP靶點，測序質(zhì)量良好纪隙，使用僅20個細胞或單個組織切片即可赊豌。此外，ARTR-seq程序中可以輕松添加成像步驟绵咱，提供RBP的直接空間信息碘饼。通過ARTR-seq，研究團隊展示了剪接因子和RNA m6A修飾的YTH家族閱讀器蛋白的獨特結(jié)合模式悲伶。ARTR-seq無偏倚地檢測了細胞質(zhì)和細胞核中RBP與RNA的結(jié)合派昧，并測量了RBP在RNA底物上的結(jié)合強度。此外颤皆，ARTR-seq可以在10分鐘的時間尺度上監(jiān)測G3BP1在應激顆粒（SG）組裝過程中的動態(tài)RNA結(jié)合。

ARTR-seq策略和驗證

英文：https://www.nature.com/articles/s41592-023-02146-w